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      Annexin V细胞凋亡实验原理及应用

      来源 :js3333线路检测中心生物   发布时间:2024-05-11 14:52   点击量:

      细胞凋亡,也被称为程序性细胞死亡,是一种有序的、由基因控制的细胞死亡方式。它是生物体正常发育和维持内环境稳定的关键机制之一。

      细胞凋亡过程常伴随明显的形态学变化,比如在凋亡早期 ,细胞膜上磷脂酰丝氨酸(PS)的外翻 。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,它对于磷脂酰丝氨酸(PS)有极强的结合力。在细胞凋亡早期  ,原本只分布在正常细胞膜脂质双层内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)会翻向外侧 ,暴露在细胞外环境中。此时 ,用标记了荧光素(如FITC)的Annexin V作为荧光探针,可以特异地与外翻的PS结合,从而标记出凋亡早期的细胞 。PI(Propidium iodide)是一种核酸染料 ,它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜  ,但可以透过凋亡晚期或者坏死细胞的细胞膜,与细胞核结合呈现红色 。

      将Annexin V-FITC与PI联合使用,可以实现凋亡早期 、凋亡晚期或者坏死细胞的区分。在流式细胞仪或荧光显微镜下观察,早期凋亡细胞由于细胞膜完整 ,PI无法进入,仅显示Annexin V-FITC的绿色荧光;而凋亡晚期或者坏死细胞由于细胞膜通透性增加 ,PI可以进入并与细胞核结合,同时Annexin V-FITC也能结合外翻的PS,因此这些细胞会同时显示绿色和红色荧光 。

      细胞凋亡状态

      了解完Annexin V细胞凋亡实验原理后,下面我们一起看一下具体的实验流程。

      Annexin V细胞凋亡实验流程

      1.获得好的实验结果,需要做好实验前的准备工作,首先得设置好实验方案,具体如下(按照Annexin V-FITC/PI试剂盒用流式细胞仪器检测为例)。

      组别 实验目的
      空白对照(Blank) 调节阈值和仪器电压
      Annexin V-FITC单阳组 调节补偿,辅助调节电压
      PI单阳组
      生物学对照(Negative) 排除实验操作对实验结果的影响,划门依据
      实验组(Test) 实验结果

      2.消化贴壁细胞

      对于贴壁细胞,先用适量胰酶(不含EDTA)消化细胞,而悬浮细胞可省去此操作 。

      需要注意以下几点:

      1)由于EDTA是Ca2+螯合剂 ,EDTA会络合Ca2+,从而影响Annexin V与PS的结合  ,若使用含EDTA的胰酶有可能会造成假阴性,所以建议用不含EDTA的胰酶消化贴壁细胞。

      2)如需使用含EDTA的胰酶消化细胞 ,有必要在染色之前用PBS或结合缓冲液洗涤细胞多次以去除EDTA,从而避免螯合Annexin V所必需的Ca2+ 。

      3)消化细胞的时间不能太久,处理细胞时要轻柔 ,若过度消化或机械损伤细胞都会导致细胞膜受损 ,从而造成假阳性 。

      4)培养基中也存在已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞,因此也收集下来进行检测。

      5)检测前细胞密度为80%-90%即可,细胞过密会导致细胞出现大量凋亡,增加了凋亡细胞的比例

      3.重悬细胞

      无论是悬浮细胞还是贴壁细胞(消化后)进行细胞重悬 ,轻柔吹打洗涤,并离收集细胞,制备细胞悬液,进行计数。

      4.取细胞悬液(细胞总数为1-5×10 ⁵cells)加入荧光标记的Annexin V和碘化丙啶 (PI)轻轻混匀,室温避光孵育15min。

      5.染色孵育后,立即进行流式细胞仪检测或荧光显微镜检测。流式细胞仪检测时,以Annexin V-FITC为例,可使用FITC通道(通常是FL1)检测Annexin V-FITC 。PE通道(通常是FL2)检测PI。用流式软件进行分析 ,以FITC为横坐标 ,PI为纵坐标 ,绘制双色散点图。

      流式结果图:

      流式结果图

      凋亡实验中主要分析细胞凋亡早期,流式凋亡结果图各个象限结果代表如下:

      左上象限(Annexin V-/PI+):左上象限为裸核细胞;Annexin V-/PI+象限中细胞数越多,实验结果可信度就越低,因尽量控制本象限细胞比例 。

      左下象限(Annexin V-/PI-):左下象限为正常的活细胞;

      右上象限(Annexin V+/PI+):右上象限为晚期凋亡细胞或坏死细胞,细胞膜损伤的细胞DNA可被PI着染产生红色荧光 ;

      右下象限(Annexin V+/PI-)  :右下象限为早期凋亡细胞,在细胞凋亡的早期PI无法着染 ,不会产生红色荧光信号。

      1 、对照组比处理组凋亡比例高:

      a.细胞培养状态不理想 ;

      b.收集细胞后,没有及时染色 ;

      c.过分吹打 、震荡,导致细胞膜受损,PS暴露出来。

      2 、处理组比对照组凋亡比例低:

      a.对细胞凋亡诱导刺激强度不足;

      b.过度增殖的细胞对凋亡诱导不敏感 ;

      c.贴壁细胞消化时间过长,导致膜表面的PS受损 ,Annexin V结合位点减少。

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      货号 :K018 ,产品名称:Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Kit
      货号:K019,产品名称 :Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit
      货号:K070,产品名称 :Annexin V-EGFP/7-AAD Apoptosis Kit
      货号:K071 ,产品名称:Annexin V-FITC/7-AAD Apoptosis Kit
      

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